激光扫描共聚焦显维镜定量分析的优势和注意事项

激光扫描共聚焦显微镜与图像半定量分析相比，具有以下优点：
 
    1．更精细、度更高。激光扫描共聚焦显微镜对免疫荧光组织化学染色样品做定量分析时，利用激光聚焦和系统软件分析对组织进行深层扫描，不破坏组织细胞结构，可深层次准确定位并定量。而一般图像分析只是以荧光灰度的差别变化进行半定量分析。
 
    2．激光扫描共聚焦显微镜一般有两个以上不同波长的激光管，只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析两种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，而又方便，这一特点是一般图像分析*的。
 
    3．激光扫描共聚焦显微镜可根据需要提供纯荧光、白光以及荧光与白光合成图像等多种图像，远远优于一般图像分析。
 
    4．以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，用石蜡切片在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强影响观察结果。而石蜡标本来源广泛，适用于回顾性研究。激光扫描共聚焦显微镜可扫描石蜡切片的荧光染色，可避免因背景非特异性荧光过强而影响观察结果，从而可获得清晰图像，这也是激光扫描共聚焦显微镜的优势所在。
 
激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项
 
《一》制备高特异性和价的荧光抗体
 
    标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。
 
《二》标本制作要求
 
    1．标本厚度  组织切片或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在标本下部，而物镜观察的上部不能被充分激发。
 
    2．载玻片  载玻片要光洁，无自发荧光；载玻片厚度应在0．8～1．2mm之间，太厚会吸收较多的光，不能使激发光在标本上聚焦。
 
    3．封固剂  甘油必须无色透明，无自发荧光。由于荧光在pH 8．5～9．5时较亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。
 
《三》定量研究的要求
 
    1．随机性
    （1）在感兴趣区域内随机抽样，不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”，这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。
    （2）在随机抽取的切片上，应随机抽取观察视野。
    （3）在随机抽取的视野中，通过连续观察“光学切片”，得到感兴趣结构的三维定量信息。如果不能连续观察“光学切片”，需要在Z轴方向随机抽样，然后作定量研究。
 
    2．避免参照陷阱  如果获得的资料是密度信息，当比较各组参照空间（包含待测结构的区域）的体积不同时，根据密度信息可能得出错误结论。因此，需要注意所谓的参照空间“陷阱”问题。